Diagnoza botulizma temelji na identifikaciji toksina Clostridium botulinum v laboratoriju in na opazovanju kliničnih simptomov, čeprav so včasih nespecifični. Bolezen lahko dejansko zamenjamo z Guillain-Barréjevim sindromom, poliomijelitisom, kapjo, miastenijo gravis in paralizo klopov.
V živilskem botulizmu so pomembni podatki o živčno-mišičnih motnjah in zaužitju potencialno kontaminirane hrane. Hkratna manifestacija pri vsaj dveh bolnikih, ki so jedli isto hrano, poenostavlja diagnozo. Potrditev se dobi tako, da se mikroorganizem izolira s testom kulture za sumljive vzorce hrane ali iztrebke bolnika in z identifikacijo botulinskega toksina v živilih ali bioloških materialih (kot so kri, želodčni sok in bruhanje).
Po drugi strani pa pri botulizmu rane diagnoza serumskega toksina ali izolacija Clostridium botulinum iz vzorca kožne lezije to potrjuje.
